В 1985 г. окончил филологический факультет Московского государственного педагогического института им. В. И. Ленина (ныне Московский педагогический государственный университет) по специальности «учитель русского языка». В 2001 г. защитил диссертацию на тему «Политологический анализ процесса становления федеративных отношений в России».
После окончания вуза работал диспетчером Московского городского бюро путешествий и экскурсий, инженером в Центре содействия творческой инициативе «Сотрудничество».
Участник неформального движения, член клуба «Перестройка» и группы «Перестройка-88». Вместе с Вячеславом Игруновым, Владимиром Прибыловским и др. занимался выпуском самиздатской газеты «Хронограф», был одним из ее авторов. Работал в научно-аналитическом центре кооператива «Перспектива» по изучению самиздата, оказанию содействия изданиям различных неформальных групп.
1990 г. — вместе с Вячеславом Игруновым основал исследовательский центр «Московское общественное Бюро информационного обмена», на основе которого в 1990 г. был учрежден Институт гуманитарно-политических исследований (ИГПИ).
В 1993 г. — накануне первых выборов в Госдуму участвовал в создании избирательного блока «Явлинский — Болдырев – Лукин» («Яблоко»).
12 декабря 1993 г. был избран депутатом Государственной думы РФ I созыва, вошел в состав комитета по делам Содружества Независимых Государств и связям с соотечественниками, был членом фракции «Яблоко».
17 декабря 1995 г. — избирался депутатом Госдумы II созыва от «Яблока».
1995 — 2003 гг. занимал пост заместителя председателя думского комитета по вопросам местного самоуправления. 1995 г. — вошел в состав бюро центрального совета объединения «Яблоко».
19 декабря 1999 г. — избирался депутатом Госдумы III созыва от «Яблока».
В 2000 г. избран секретарем объединения по идеологии.
В 2004-2018 гг. — глава московского регионального отделения партии «Яблоко». 2 июля 2018 г. федеральное бюро партии приостановило полномочия Сергея Митрохина как председателя московского отделения.
В июне 2004 г. Сергей Митрохин был избран председателем Комитета защиты москвичей, общественной организации, созданной для борьбы с нарушением жилищных прав горожан и незаконной застройкой столицы.
4 декабря 2005 г. – избран депутатом Московской городской думы IV созыва по общему списку кандидатов «Яблока» и СПС (2005-2009).
В 2004-2008 гг. — заместитель председателя Российской объединенной демократической партии «Яблоко» (до 2006 г. — Российская демократическая партия «Яблоко»).
В 2008-2015 гг. — председатель Российской объединенной демократической партии «Яблоко».
На XV съезде «Яблока» 21-22 июня 2008 г. избран новым председателем партии, сменил на этом посту Григория Явлинского.
16 июня 2012 г. — был переизбран председателем Российской объединенной демократической партии «Яблоко».
В 2013 г. — выдвигался кандидатом от «Яблока» на выборах мэра Москвы. По итогам голосования 8 сентября того же года получил 3,51% голосов избирателей, занял 4-е место.
4 марта 2014 года — осудил законопроект «Справедливой России», позволяющий осуществить присоединение Крыма.
В мае 2014 года в 6-й раз переизбран председателем Московского регионального отделения «Яблоко».
19 декабря 2015 г. — были приняты изменения в устав, запрещающие занимать пост председателя партии одному лицу более двух сроков. В результате Сергей Митрохин не смог принять участие в выборах председателя партии «Яблоко».
В мае 2016 года в 7-й раз переизбран председателем Московского регионального отделения «Яблоко».
В 2017 году участвовал в борьбе против программы реновации жилья в Москве, основал «Комитет Спасения Москвы».
Депутат Московской городской думы VII созыва с 8 сентября 2019 года. Генеральный директор градозащитной некоммерческой организации «Центр Столица», кандидат наук.
В январе 2022 года Митрохину запретили выезд из-за административных дел о правонарушениях в связи с участием депутата в прошлогодних несанкционированных акциях 27 января на Пушкинской площади и «пикете бомжей» у Совета Федерации 17 марта. За данные правонарушения были взысканы штрафы в размере 300 и 150 тыс. руб., которые Митрохин оплатил.